熒光定量PCR儀的熱蓋失效或故障最主要的表現(xiàn)是：控溫不準(zhǔn)和液體揮發(fā)，反應(yīng)液揮發(fā)會(huì)最終導(dǎo)致曲線不擴(kuò)增，呈斜線上升。首先可通過(guò)曲線判斷熱蓋是否故障，若確定熱蓋已經(jīng)壞了，建議可以在每個(gè)PCR反應(yīng)管中加入一層礦物油（礦物油可避免反應(yīng)液揮發(fā)），上機(jī)測(cè)試曲線結(jié)果是否正常。如曲線仍然異常，則建議請(qǐng)儀器工程師現(xiàn)場(chǎng)維修，甚至直接更換熱蓋。

　　通常我們建議在實(shí)驗(yàn)室配備UPS電源，這樣能夠保證PCR儀器運(yùn)行過(guò)程中的正常供電，從而保證程序的正常運(yùn)行。PCR儀器在運(yùn)行中突然斷電的話，如儀器有斷電保護(hù)功能，則可直接繼續(xù)運(yùn)行程序。如實(shí)驗(yàn)室無(wú)UPS電源，突然斷電而導(dǎo)致PCR程序不能完成，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，建議只能重復(fù)實(shí)驗(yàn)再上機(jī)檢測(cè)。

要判斷自己的PCR儀器是否正常，可從以下幾方面考慮：1.    儀器開(kāi)關(guān)機(jī)，與軟件連接是否正常。2.    儀器運(yùn)行同樣的實(shí)驗(yàn)所需要的時(shí)間是否跟平時(shí)一致，由此判斷儀器的加熱制冷模塊是否正常。3.    曲線結(jié)果是否呈明顯的S型，若曲線異常，如呈曲折上升狀，則可能是熱蓋問(wèn)題，或者是熒光檢測(cè)裝置出現(xiàn)問(wèn)題。4.    若曲線的熒光值與平時(shí)相比，明顯降低，則要考慮是否需要更換儀器光源（尤其是鹵素?zé)簦涔庠磯勖s2000h）。5.    若儀器某一孔或幾孔的熒光值明顯高于其他孔位，則需要考慮儀器的孔槽或檢測(cè)光路是否受到熒光污染，建議清洗儀器孔槽后再進(jìn)行測(cè)試。

　　如實(shí)驗(yàn)室的擴(kuò)增產(chǎn)物泄露，造成實(shí)驗(yàn)室的污染，那么后果將非常嚴(yán)重。要去除污染，首先最重要的是保持通風(fēng)，保證擴(kuò)增產(chǎn)物片段能順利擴(kuò)散出去；其次可采用稀酸處理法，對(duì)可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤；再次采用紫外照射法，紫外波長(zhǎng)（nm）一般選擇254/300nm，需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時(shí)，要考慮PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV照射僅對(duì)500bp以上長(zhǎng)片段有效，對(duì)短片段效果不大；最后若污染長(zhǎng)時(shí)間不能消除，建議更換另外廠家的PCR試劑進(jìn)行檢測(cè)，因?yàn)槊總€(gè)廠家的引物設(shè)計(jì)區(qū)域不一樣；一般情況下，一家試劑公司的擴(kuò)增產(chǎn)物不會(huì)在另外一家廠家的引物設(shè)計(jì)區(qū)域內(nèi)，因此不會(huì)造成產(chǎn)物污染的假陽(yáng)性。

1）為了保證檢測(cè)質(zhì)量，臨床PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有充分合理的空間，良好的照明和空調(diào)設(shè)備。工作環(huán)境雖不是檢測(cè)質(zhì)量的直接原因，但寬敞舒適的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境將肯定有利于檢驗(yàn)質(zhì)量的保證。

2）合理有效地對(duì)儀器設(shè)備進(jìn)行管理，定期做維護(hù)和校準(zhǔn)，使其處于一個(gè)良好的狀態(tài)。例如，定期校準(zhǔn)移液器，使其保持足夠的準(zhǔn)確度和精密度。定期維護(hù)熒光定量PCR儀的光學(xué)系統(tǒng)和反應(yīng)孔間溫度差異，使其保持在良好狀態(tài)和允許的范圍內(nèi)。此外，還包括天平，離心機(jī)，冰箱等設(shè)備的管理。

3）理想的試劑：主要有內(nèi)外兩個(gè)因素，內(nèi)在因素包括標(biāo)本處理方法，用于核酸擴(kuò)增的原材料及方法學(xué)設(shè)計(jì)等。外出因素包括試劑盒的運(yùn)輸和保存中的問(wèn)題。

4）標(biāo)準(zhǔn)化操作流程：完整的臨床PCR程序由標(biāo)本采集，運(yùn)送，保存，編號(hào)，試劑準(zhǔn)備，核酸提取，擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)，結(jié)果分析和報(bào)告等諸多環(huán)節(jié)，建立科學(xué)和與本實(shí)驗(yàn)室配套的SOP文件，嚴(yán)格按SOP進(jìn)行操作。

5）主要污染源和防污染措施：PCR的主要污染源有標(biāo)本中的大量待測(cè)微生物，克隆質(zhì)粒，大量存在實(shí)驗(yàn)室中的特定微生物以及以前擴(kuò)增產(chǎn)物的殘留污染等。這些都是實(shí)驗(yàn)室最容易造成假陽(yáng)性的污染。因此，必須嚴(yán)格分區(qū)實(shí)驗(yàn)室及遵守工作流程，使用化學(xué)清潔實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，使用紫外線照射和UNG方法消除擴(kuò)增產(chǎn)物污染等等。

6）進(jìn)行室內(nèi)和室間質(zhì)量控制，室內(nèi)質(zhì)量控制可以確保實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)測(cè)定質(zhì)量的一致性，室間質(zhì)量控制可以提供將實(shí)驗(yàn)室測(cè)定情況與一室間和客觀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行回顧性比較的數(shù)據(jù)。

　　國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)，乙肝兩對(duì)半標(biāo)志物全陰性的病人不能排除HBV DNA感染，主要是因?yàn)镠BV DNA的檢測(cè)窗口期出現(xiàn)早于乙肝血清標(biāo)志物，因此此類患者可能處于乙肝感染早期。 　　乙肝感染后，在乙肝“兩對(duì)半”檢測(cè)中，表面抗原HBsAg出現(xiàn)最早，一般在感染3周后出現(xiàn)，而HBV DNA的檢測(cè)能將窗口期縮短至6-15天，乙肝兩對(duì)半全陰的標(biāo)本HBV DNA為陽(yáng)性，是因?yàn)椴∪颂幱诟腥疽腋尾《镜某跗冢庖邔W(xué)的檢測(cè)窗口期比基因檢測(cè)的窗口期長(zhǎng)，導(dǎo)致兩對(duì)半檢測(cè)結(jié)果為陰性，由此可知：HBV DNA的檢測(cè)，對(duì)于疾病的早期診斷有著非常重要的意義。

　　HBV-DNA檢查是反應(yīng)乙肝病毒復(fù)制程度和傳染性大小的最直接指標(biāo)。臨床數(shù)據(jù)顯示，在乙肝兩對(duì)半大三陽(yáng)病例  中，HBV DNA陽(yáng)性的檢出率極高，但HBV DNA陰性的結(jié)果也是很有可能的。一般乙肝大三陽(yáng)HBV-DNA陰性雖然表明患者病毒未超標(biāo)，但大三陽(yáng)結(jié)果提示患者感染乙肝病毒，且具有較強(qiáng)傳染性。盡管如此，臨床檢驗(yàn)者也可能遇到大三陽(yáng)標(biāo)本HBV DNA檢測(cè)不出的情況。首先對(duì)于這樣的標(biāo)本，可以將標(biāo)本進(jìn)行稀釋后進(jìn)行復(fù)查，排除血清或血漿標(biāo)本中存在抑制物或者陽(yáng)性標(biāo)本HBV DNA濃度超過(guò)試劑盒上限而導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗的情況。其次，乙肝病毒發(fā)生變異也是導(dǎo)致PCR擴(kuò)增不出的原因之一，通常都是用藥治療患者的乙肝病毒核酸序列發(fā)生了突變。如經(jīng)過(guò)多種PCR試劑檢測(cè)失敗后，可進(jìn)行DNA測(cè)序以確定乙肝病毒及其變異位點(diǎn)，以指導(dǎo)臨床醫(yī)生用藥治療。最后， 可更換另一廠家試劑進(jìn)行檢測(cè)，排除原試劑本身設(shè)計(jì)缺陷而造成漏檢的情況。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線包括基線期，指數(shù)擴(kuò)增期，線性擴(kuò)增期和擴(kuò)增平臺(tái)期，標(biāo)準(zhǔn)的曲線應(yīng)該呈典型的S型。不規(guī)則曲線可以根據(jù)曲線的具體情況來(lái)分析：1）曲線呈斜線上升原因：熱蓋失靈或熱蓋沒(méi)蓋緊，導(dǎo)致控溫不準(zhǔn)、液體揮發(fā)。解決辦法:更換儀器熱蓋或?qū)嵘w蓋緊。圖1 曲線呈斜線上升2）擴(kuò)增曲線分成兩段（斷裂）圖2擴(kuò)增曲線分成兩段（斷裂）原因：基線的終點(diǎn)大于Ct值，通常是因?yàn)槟０錎NA濃度偏高，CT值< 15，而基線仍然取3-15，其中包含部分?jǐn)U增信號(hào)，導(dǎo)致曲線被壓下去。解決方法：減小基線終點(diǎn)，至Ct值前4個(gè)循環(huán)，重新分析數(shù)據(jù)。3）直線擴(kuò)增曲線圖3 某些樣本出現(xiàn)直線擴(kuò)增曲線原因：探針部分降解解決辦法:建議更換試劑進(jìn)行測(cè)試。4）曲線平臺(tái)期下掉原因：蓋子沒(méi)蓋緊解決辦法:PCR反應(yīng)管蓋子蓋上后，檢查蓋子是否蓋緊。圖4 曲線平臺(tái)期下掉